新冠核酸“假阳性”频发，气溶胶污染值得所有检验人警惕
面对频频爆出的“第三方检验机构屡次暴雷”、“多家实验室频频爆出假阳性”、“为了赚钱故意制造假阳性”等新闻，在国家卫健委的高度严格要求下，我们检验科核酸检测实验室能做些什么，该做些什么？5月23日，国家卫生健康委医政医管局监察专员郭燕介绍：“尽管核酸检测的特异性为100%，但在实际工作中，实验室可能因实验过程的操作造成污染而导致假阳性。”检测的准确性是所有检验实验室的生命线。而造成假阳性最主要的原因是核酸气溶胶污染问题。下面就PCR实验室出现假阳性（核酸污染）的具体原因及应对措施分析如下：较常见，尤其是第一代PCR技术，发生概率在60%以上。PCR产物经反复多次的扩增，其复制量远远超过PCR的检测极限，一个气溶胶所包含的拷贝数可以在104~106copies，这个拷贝数对应的PCR检测Ct值在24左右！因此即使是极微量的污染也足以造成实验结果假阳性。
但是，在第二代PCR技术中，采用了防污染UNG/UDG技术，该技术可以显著降低扩增产物引起的污染，则该因素发生污染的概率能降低到10%以内。而国内几乎所有获批准的新冠检测试剂盒，均采用了UNG防扩增产物污染技术；因次，扩增产物引起的污染概率，并没有大家想象中那么高。如果密封不严，扩增完成后有蒸发现象，液面不整齐，或者扩增过程中有炸管声音，则应该更换PCR扩增管/封板膜的批次或者供应商。以重组质粒作为阳性质控品，发生污染的概率更大；以构建的假病毒或重组病毒作为阳性质控品，参与核酸提取的过程中，也容易发生气溶胶污染；在试剂的配制过程中，接触了污染的容器、移液器、枪头、溶液等物导致试剂被污染。笔者认为，这是目前实验室引起的核酸污染最主要原因！
放置样品的容器被污染，或由于容器密封不严导致样品与外界接触被污染；待提取样本中含有强阳性样本，其提取的样品中含有高浓度的阳性核酸，形成气溶胶，造成污染。气溶胶是由空气与液体表面摩擦而产生的，开盖、晃动反应管及污染加样器的反复吸样都可形成气溶胶，从而导致交叉污染。以上核酸来源，均形成气溶胶扩散至空气中，或吸附到物体表面。因此，应尤其重视由气溶胶导致的污染问题。重度污染假阳性的ct值可在24左右，中度污染ct值在30左右；轻度污染ct值在33左右。从核酸污染的分布来看，主要在2个地方：
空气中的核酸气溶胶：弥散到实验室各个角落，比较棘手；吸附到仪器设备表面上的核酸污染物：移液器、离心机、核酸提取仪、传递窗、拆开的试剂盒、枪头盒、打开的耗材等表面。
PCR实验室只要出现了污染，之前的结果报告就变为了无效，而且也无法进行其他的实验操作。必须找出并彻底清除污染源，才能得到准确有效的实验结果。
严格的PCR实验室应有标准的正负压系统及四分区，实验室应按照生物安全二级实验室及PCR实验室设计基本要求来建设。
可参考的标准为《GB50346-2011建设标准生物安全实验室建筑技术规范》及卫健委下发的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。
另外说些现行技术指导原则里面没有提到，但也最容易忽视的风险点！
现有技术指导原则只要求了选择BSL-Ⅱ级生物安全柜，但并未规定具体型号。从2区负压的角度考虑，建议配置的是A2型。但是从临床观察来看，非B2型生物安全柜污染的概率远远大于B2型，因此建议使用B2型号生物安全柜加核酸模板。
A1型、A2型、B1型为70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区；B2型为100%全排放型，无内部循环气流。因此只有B2型可以用于加样（阳性对照）。因为HEPA过滤器并不能有效过滤气溶胶质粒。若生物安全柜配置错误，在加样的时候，循环风很容易造成核酸气溶胶的形成，从而造成污染，且污染很难清除。
紫外灯能杀灭病毒，但是《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》指出，短片段的基因核酸对紫外线损伤不敏感。常规消毒剂如酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌，但是不能降解核酸，或降解效率较差。尤其是酒精，它其实是核酸提取试剂中的一个组分。已知的消毒剂中，次氯酸盐类消毒剂可以一定程度的降解核酸，但是腐蚀性强，不能处理精密仪器及金属制品。处理样本时，手套贴合性不够；处理样本时，忘记更换tip枪头，造成样本交叉污染；处理阳性样本时，造成其他样本污染，从而造成假阳性。吸取阳性对照（质粒）没有遵循“慢吸快打”的原则（这个需要练习，形成肌肉记忆），往往是“快吸快打”，造成阳性样品污染枪头；或者在生物安全柜循环风的影响下，造成气溶胶飞溅，污染加样区域，最好使用带有滤芯的枪头。
加样区没有放置桌面垃圾桶：加完样品的tip枪头可能含有高浓度的阳性核酸靶标，如果乱丢弃，可能造成气溶胶污染。应把tip枪头丢入含有次氯酸溶液的桌面垃圾桶中。因为次氯酸容易挥发，因此应每天更换含氯消毒液！在笔者的临床实践中，发现以下区域存在阳性污染的概率更大：笔者在某实验室发生污染时，在不同区域分别采集10个样本，通过PCR扩增分析后，比较不同区域的阳性检出率。发现样品处理区的核酸提取仪与离心机污染的程度最高（8/10）。在临床实践中，移液器也是污染的高风险项。不同实验室的污染情况都是不一样的，就像这个世界上，幸福的家庭都一样，不幸的家庭倒是各有各的不幸。同理，规范的实验室都一样，污染的实验室各有各的污染情况。以上数据仅供参考。在日常实验室运行中，要时刻注意监测实验室的污染情况，了解实验室有无污染、污染原因、污染程度，以便采取有效措施，防止和消除污染。
目前，多数试剂盒的阴性对照是在配置PCR反应液，上机扩增这一环节进行质控，没有对核酸提取进行质控。因此，每次开展试验应增加3个纯化水样品，分布于待检样品的前、中、后位次或棋盘法随机放置，参与核酸提取、扩增，保证实验样品处理、核酸提取、扩增3个步骤的全过程的阴性监控。防止整个试验过程中可能存在的阳性污染。每个实验区放置10ml纯化水或生理盐水（敞口），1个小时后取样200μl，作为样品，参与提取、扩增，分析实验室环境是否存在气溶胶污染。物体表面擦拭取样：用棉拭子蘸取生理盐水，在实验室台面（尤其是四周死角）、仪器表面和内孔涂抹取样后，放入约0.5ml生理盐水中取样，作为样品，参与提取、扩增，分析物体表面是否存在气溶胶污染。
解决PCR实验室污染的方法：第二代PCR CLEANER 2.0策略。首先针对上述产生气溶胶污染的原因进行分析，从人员、硬件配置、物料、方法（SOP）、环境五个方面进行认真复盘，整改。发生污染时，处理措施根据污染的区域来源：空气中的核酸气溶胶污染和吸附到仪器设备上的核酸污染物。
紫外线照射无法降解200bp以下的短片段核酸，作用距离以及效果非常有限，并且容易产生处理死角。
可以通过纳克生物研发的第二代非雾化原理的“PCR CLEANER 核酸气溶胶污染清除仪”对空气中的气溶胶进行清除！
清除效率高，最快可2小时解决空气中的气溶胶污染问题！“她”更大的价值是，每天实验结束，打开仪器60~120分钟，能大大降低实验室的污染概率。毕竟核酸气溶胶的污染，预防大于治理！“不污染”才是最好的治理！
更换污染区的耗材（主要是吸头和离心管）；实验服、工作服应用次氯酸盐溶液浸泡1小时后，进行洗涤处理；尽量使用一次性生物安全Ⅱ级防护服。可以选用没有腐蚀性、对试验人员及环境友好、无刺激的核酸清除剂，例如纳克生物推出的第二代核酸污染清除解决方案：“PCR核酸质粒气溶胶污染清除剂”。主要原理是通过酶解作用，清除效果较强，比常见的强氧化剂（次氯酸盐）降解效果要好！更加安全！无腐蚀性，无致畸、致癌性。该试剂可以处理易腐蚀的区域，如在移液器、生物安全柜、离心机、传递窗等区域进行喷洒清除。用次氯酸盐如84消毒剂（具有腐蚀性，不能用于金属制品）喷洒实验室桌面、地面、墙面，20分钟后用一次性吸水纸或者干净抹布擦拭干净。有效氯含量应不低于6g/L。打开实验室所有紫外灯（生物安全柜、传递窗、实验室等），12h后打开通风系统即可解除污染。注意：试验耗材、工作衣等进行121℃30分钟高压，虽然有一定的作用，但并不能完全去除质粒核酸的污染。严禁PCR扩增产物进行高压，尤其是在2区进行高压，高压蒸汽非常容易造成扩增产物气溶胶扩散。
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