前沿疗法下游纯化面临挑战，如何应对？
创新型的细胞疗法、基因疗法有望彻底改变传统医学的想象，满足未满足的临床需求并提供持久性治愈的可能。因此，该领域也引起了广大制药厂商的热情和兴趣，市场规模的复合年增长率高达54%。
EvaluatePharma预计，到2026年，该领域市场价值将达到590亿美元。然而，制造这些复杂革命性新疗法的难度非常大，其中的下游加工环节更是颇具挑战。
市场上目前已有多种基因疗法获批。通常来说，使用病毒载体是向基因治疗产品的首选途径，最常见的三种基因治疗载体分别是腺病毒、腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）。
表1：获得许可的基因治疗产品
表2：基因疗法常见的病毒载体
常见的病毒基因疗法包括以下两种：
体内基因治疗
使用病毒载体将基因引入患者体内的细胞并传递相应的基因。这种方法通常是为了增加或替换低水平转基因编码的蛋白质，Luxturna和Zolgensma是采用体内基因治疗的代表性疗法。
离体基因治疗
从患者身上提取细胞并用病毒载体处理，再将基因传递给提取的细胞，然后将这些修饰过的细胞输注回患者体内。嵌合抗原受体CAR-T疗法普遍采用这种方法（比如Kymriah），通常使用慢病毒将基因传递给患者T细胞。使用蛋白质生物分子（如抗体），可以在氨基酸水平评估分子结构，并且可以同时确定色谱树脂的精确结合位置。然而，使用病毒载体导致了制造工艺需要有更高级别的复杂性。病毒载体由数十到数百个单独的蛋白质组成的纳米粒子，而这些蛋白质以独特的三维结构排列组合。
综合来看，所有病毒基因疗法的制造难度和下游挑战都是相似的，具体取决于所使用的病毒载体类型，以及所传递的基因编码和治疗类型（体内或体外）。与单纯的蛋白质产品相比，制备复杂的基因疗法还需要考虑病毒载体的大小和复杂性。
目前，有许多疗法主要针对罕见疾病，使用病毒载体治疗较小规模的患者群体。传统上，纯化策略更加专注于病毒大小和密度特性，涉及使用密度梯度超速离心等。AAV纯化的典型过程十分复杂，需要利用空衣壳（1.32g/cm3）和完整衣壳（1.40g/cm3）之间的微小密度差异，通过超速离心的方法将空衣壳（非活性）与含转基因衣壳活性分离。这一步骤非常耗时（数小时），而且需要重复进行多次，才能达到所需的衣壳分辨率。此外，用于形成梯度的化学制品（如氯化铯）价格昂贵，而且分离完成后还需要从最终产品中去除这部分杂质，并且整个处理过程是人工密集型产业，难以用机械自动化取代。
图2：AAV纯化的典型过程
制备过程的困难导致了基因治疗产品的售价往往相当高昂（比如Zolgensma治疗成本高达210万美元），使其仅适用于需要小剂量病毒载体的情况。治疗其他单基因疾病（如血友病、杜氏或帕金森病），需要更多可扩展的纯化方法。
目前，研发人员已经通过多级色谱法技术，构建病毒载体下游加工的替代方法来解决这一问题。在制备过程中，清除宿主细胞成分（蛋白质、核酸）以及控制与所需产品相关的物种都是十分必要的，此外过程中还需要从含有转基因的衣壳中分离出空衣壳。
1、病毒载体的色谱矩阵
蛋白质纯化通常使用多孔颗粒形式的层析介质，通过对流流动使蛋白质纯化珠表面可以被吸附。蛋白质纯化珠的孔径为15至40nm，吸附的病毒载体将被限制在蛋白质纯化珠表面，进而导致容量遭到了限制。虽然可以增加蛋白质纯化珠的孔径，但这将会降低蛋白质纯化珠的结构完整性，使其难以装入色谱柱。使用色谱固定相的替代形式也可用于病毒载体，包括离子交换、疏水相互作用、混合模式等。这些替代形式不受孔径扩散问题的影响。
2、病毒载体的亲和层析
基于蛋白A与IgG分子Fc区结合的亲和层析是一种高效的捕获机制，适用于所有单克隆抗体（mAb）产品，并且能够制造出纯度高于98%的产品。该平台过程适用于单克隆抗体的开发制造及分离，目前已开发出可结合特定AAV血清型（8,9）或血清型组（1至5,1至9）的亲和配体。然而，AAV需要在中性pH值下进行结合，而洗脱过程则需要将pH值降低至2至3。洗脱过程也需要严格控制，尽量减少AAV处于低pH值的时间，避免AAV载体发生失活。
3、空/全衣壳分辨率
除了完整衣壳和空衣壳之间的密度差异外，空衣壳的等电点（pI）也存在电荷差异，与完整衣壳相差0.4个pH单位。最佳的条件是在色谱模式pH值约为9的情况下进行阴离子交换，空衣壳会比完整衣壳更早洗脱。然而，对于制备工艺来说，该过程所需的梯度长度（100CV）是不切实际的，但在确定了空壳和满壳的洗脱条件后，转换为阶梯梯度可以为衣壳分辨率提供可扩展的制造方法。
4、病毒载体大小
与来自宿主细胞的其他物种（例如蛋白质和核酸酶消化后的核酸片段）相比，病毒载体的大小意味着切向流过滤可以实现从宿主细胞杂质中有效地纯化病毒载体。因此需要研发和使用新型的缓冲液，使其满足避免病毒载体聚集的同时，能够减少宿主细胞成分与病毒载体结合。
在证明了病毒载体可以为未满足的医疗需求带来临床疗效之后，制造下游面临的主要挑战是通过可扩展的工艺来降低制造成本，同时提供治疗所需的高质量疗法产品。尽管目前存在相应的解决途径，但仍需要进一步完善和开发。
其中，血清型依赖就是AAV当前面临的主要挑战之一。由于临床应用中需要使用不同的血清型来靶向定位患者不同的细胞或组织，因此开发适用于各种AAV血清型的稳健纯化平台仍然是一个需要解决的目标。此外，在简化病毒载体下游工作流程中，需要进行突破的领域还包括对全衣壳均具有选择性的树脂开发。
目前，基因递送领域有两个热点一直受到研发领域的关注。
第一个是使用细胞外囊泡（外泌体）做为治疗载体。该载体可以穿过血脑屏障，这也是目前其他递送方法无法实现的。外泌体做为潜在疗法的纯化，遇到的难题是如何与其他细胞外囊泡的分离。
第二个关注领域是信使RNA（mRNA）。在新冠疫苗中的成功使用加速了mRNA疗法和脂质纳米颗粒（LNP）递送机制的发展。mRNA疗法制备过程中，下游的挑战与分子大小有关，mRNA疗法的制造过程与病毒载体有很大不同，mRNA需要在DNA的基础上进行基于酶的分子合成。
目有超过1000种疗法正在研发当中，而这一事实也证明了在很长一段时间内，制药厂商对细胞和基因疗法仍将存在极大的兴趣和热情。
然而，为了实现持久性治愈的承诺，研发人员还需要密切关注和解决制造流程中的种种难题，进一步改善当前前沿疗法高昂的成本和可用性问题。未来，制药厂商如果能够在下游纯化领域进行突破改进，将为实现这一目标做出重大贡献。
编译原文：Challenges in downstream purification of advanced therapies